【摘要】目的:選擇最佳人源飼養(yǎng)層，并檢測不同組織來源的人源飼養(yǎng)層細(xì)胞堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的分泌情況，探討其水平與人胚胎干細(xì)胞(hESCs)生長是否相關(guān)。方法：原代培養(yǎng)包皮真皮、子宮內(nèi)膜基質(zhì)、絨毛、輸卵管、胎兒真皮、胎兒肌肉及胎鼠成纖維細(xì)胞(MEFs);按組織來源分為7組(MEFs為對照)，同期接種同一株hESCs，從飼養(yǎng)層細(xì)胞密度、絲裂霉素作用時間等，尋找不同飼養(yǎng)層適合hESCs生長的最佳條件;按人體組織分6組，ELISA方法檢測各種人源飼養(yǎng)層細(xì)胞分泌的bFGF。結(jié)果：根據(jù)飼養(yǎng)層細(xì)胞生長特性，飼養(yǎng)層從優(yōu)到劣依次為：包皮、子宮內(nèi)膜、絨毛、輸卵管、胎皮、胎肌;根據(jù)hESCs生長狀況，飼養(yǎng)層排序?yàn)椋喊ぁ⑤斅压堋⒆訉m內(nèi)膜、絨毛、胎肌、胎皮。輸卵管、包皮、絨毛、胎肌、子宮內(nèi)膜、胎皮分泌的bFGF(pg•10-5•mL-1)分別為13.23;3.39，1.99;0.17，1.40;0.17，2.02;1.59，0.38;0.28，0.29;0.29。輸卵管與其它組織細(xì)胞分泌的bFGF差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);包皮、絨毛、胎肌之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與子宮內(nèi)膜、胎皮差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);子宮內(nèi)膜與胎皮之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：包皮來源的飼養(yǎng)層最佳，輸卵管細(xì)胞分泌的bFGF量最高，飼養(yǎng)層細(xì)胞自身分泌的bFGF和hESCs生長無必然相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】人源飼養(yǎng)層;人胚胎干細(xì)胞;堿性成纖維細(xì)胞生長因子

基礎(chǔ)與臨床研究表明，胚胎干細(xì)胞(humanembryonicstemcells，hESCs)及其衍生細(xì)胞移植后可以有效修復(fù)受損組織①⑤。而hESCs增殖需要營養(yǎng)物質(zhì)及生長因子，鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouseembryonicfibroblasts，MEFs)制作飼養(yǎng)層是最早和最常用的方法⑥⑦。然而，MEFs可能將鼠類病毒傳染給患者，干細(xì)胞治療人類疾病時，必須要求無動物源性培養(yǎng)。近幾年，人胚胎成纖維、包皮、輸卵管上皮、子宮內(nèi)膜等組織來源的細(xì)胞⑧⑩，均有報(bào)道可以支持hESCs的生長，但對于各種人源飼養(yǎng)層的評價尚存在爭議，各實(shí)驗(yàn)室結(jié)論不同。為選擇最佳人源飼養(yǎng)層，引導(dǎo)人源組織的取舍和應(yīng)用，本研究選用包皮、子宮內(nèi)膜、絨毛、輸卵管、胎兒皮膚、肌肉，6種不同的胎兒、小兒及成人組織作飼養(yǎng)層，以MEFs為對照，比較了它們對人胚胎干細(xì)胞的支持情況。MEFs促進(jìn)增殖作用主要是由于能分泌成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblastgrowthfactor，F(xiàn)GF)等促有絲分裂因子，但人源飼養(yǎng)層中生長因子含量復(fù)雜，哪些因子可促進(jìn)hESCs增殖和抑制分化目前尚未明了。一般認(rèn)為添加外源性合成的(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)有利于hESCs的生長，但飼養(yǎng)層細(xì)胞自身分泌的bFGF和hESCs生長是否存在相關(guān)性呢?我們測定了不同人源飼養(yǎng)層細(xì)胞分泌的bFGF，首次嘗試從飼養(yǎng)層細(xì)胞自身分泌的bFGF角度探討其與支持hESCs的生長是否存在相關(guān)性。

1、材料與方法

1.1 材料

1.1.1hESCs本課題組 從人囊胚中分離培養(yǎng)并經(jīng)過鑒定的第30代細(xì)胞。

1.1.2 組織來源取自中山大學(xué)附屬一院。包皮：小兒外科的包皮環(huán)切術(shù);子宮內(nèi)膜：生殖中心子宮內(nèi)膜診刮術(shù);胎兒皮膚、肌肉：胎兒中心胎兒引產(chǎn)術(shù);輸卵管、絨毛：婦產(chǎn)科輸卵管切除術(shù)和胎兒流產(chǎn)術(shù);胎鼠購自中山大學(xué)動物中心。

1.1.3 試劑及培養(yǎng)液 HumanFGFBasicImmunoassayKit(DFB50RD，USA);成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液：90%高糖DulbeccoModifiedEagleMedium(DMEM;invitrogen，USA)，10%fetalbovineserum(FBS;Hyclone，USA)，100IU/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素(Sigma，USA);hESCs培養(yǎng)液：80%Knockout-DMEM，20%Knockout-SR，L-谷氨酰胺100×β-巰基乙醇1.8μl/mL(Invitrogen，USA)，100IU/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、非必需氨基酸100×(Sigma，USA)。

1.2 方法

1.2.1 原代細(xì)胞 培養(yǎng)包皮、胎兒皮膚，胰酶過夜冷消化，取真皮膠原酶Ⅳ消化;胎兒肌肉、絨毛、胎鼠，0.25%胰酶消化;子宮內(nèi)膜，0.1%膠原酶I消化后，將腺體沉淀取基質(zhì)細(xì)胞;輸卵管，0.25%胰酶消化后，將基質(zhì)和上皮層分離，取基質(zhì)層用0.1%膠原酶Ⅳ消化。

1.2.2 最佳飼養(yǎng)層條件 選擇用10mg/L的絲裂霉素C分別作用各種細(xì)胞1h、1.5h、2h、2.5h、3h，用同一規(guī)格的培養(yǎng)皿，制作不同密度的飼養(yǎng)層，機(jī)械法將hESCs克隆切成3～16塊，轉(zhuǎn)移到鋪有飼養(yǎng)層的培養(yǎng)皿中，選擇最佳作用時間和密度。凍存大量同批次細(xì)胞備用，復(fù)蘇后計(jì)數(shù)鋪皿細(xì)胞數(shù)和未貼壁細(xì)胞數(shù)，按絲裂霉素處理和未處理分2組，比較絲裂霉C對不同細(xì)胞復(fù)蘇率的影響。復(fù)蘇率=(鋪皿細(xì)胞數(shù)-未貼壁細(xì)胞數(shù))/鋪皿細(xì)胞數(shù)

1.2.3 飼養(yǎng)層 比較用同一規(guī)格的培養(yǎng)皿，接種相同的hESCs克隆數(shù)，計(jì)算在各種飼養(yǎng)層最佳條件下hESCs的貼壁率、生長率、分化率，比較飼養(yǎng)層優(yōu)劣。貼壁率=貼壁克隆/傳代克隆;生長率=生長克隆/貼壁克隆;分化率=(部分分化克隆+已分化克隆)/克隆總數(shù)。

1.2.4 bFGF檢測 10mg/L的絲裂霉素C作用各種細(xì)胞2h，計(jì)數(shù)后放入培養(yǎng)皿，3d后吸取培養(yǎng)液，離心取上清;利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的雙抗體夾心法，按照DFB50RD試劑盒說明操作。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xs表示，應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用單因素方差分析比較各實(shí)驗(yàn)組之間的差異性。

2、結(jié)果

2.1 不同飼養(yǎng)層細(xì)胞試用情況

hESCs的生長形態(tài)及分化情況和飼養(yǎng)層細(xì)胞密度有關(guān)，飼養(yǎng)層密度小，克隆薄、圓;飼養(yǎng)層密度大，克隆厚、沿纖維方向生長。各種人源飼養(yǎng)層在一定程度上均可支持hESCs生長，以包皮較穩(wěn)定。

2.2 絲裂霉素C對不同細(xì)胞復(fù)蘇率的影響

對包皮、子宮內(nèi)膜、絨毛、MEFs等細(xì)胞復(fù)蘇率無明顯影響;胎兒肌肉、胎兒皮膚、輸卵管細(xì)胞處理后較未處理復(fù)蘇率變差(表2)。

2.3 hESCs的生長狀態(tài)

未分化hESCs：細(xì)胞小圓形，排列緊密，核仁清楚;已分化細(xì)胞：細(xì)胞大，梭形或多角形，細(xì)胞排列疏松。未分化克隆：克隆中未分化細(xì)胞>80%，可繼續(xù)傳代;部分分化克隆：克隆中未分化細(xì)胞50%～80%，可通過機(jī)械法將未分化部分繼續(xù)傳代;已分化克隆：克隆中未分化細(xì)胞<50%，不能繼續(xù)傳代。

hESCs在包皮上貼壁率，生長率和分化率和MEFs類似;在輸卵管上貼壁率波動大，但分化率較低，形態(tài)較好;在胎皮、胎肌上貼壁率和生長率較MEFs差。

貼壁率：包皮、MEFs之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與其它組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);子宮內(nèi)膜、絨毛之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，和胎皮、胎肌、輸卵管差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);胎皮、胎肌差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)和輸卵管差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

生長率：包皮、MEFs之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與其它組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);子宮內(nèi)膜、絨毛、輸卵管之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與胎皮、胎肌差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);胎皮、胎肌差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

分化率：輸卵管和所有組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);其它組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3，圖2)。

2.4 不同組織的飼養(yǎng)層細(xì)胞分泌bFGF結(jié)果

輸卵管與其它組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，包皮、絨毛、胎肌之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);包皮、絨毛、胎肌與子宮內(nèi)膜、胎皮之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);內(nèi)膜與胎皮之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。標(biāo)準(zhǔn)曲線r=0.99868說明本次實(shí)驗(yàn)技術(shù)性誤差很小。

3、討論

1998年Thomson⑥首次報(bào)道從囊胚中獲得了hESCs，其發(fā)育全能性為細(xì)胞治療和組織替代等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來廣闊的研究前景，現(xiàn)在已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)上，培養(yǎng)hESCs用MEFs、無限生長系STO細(xì)胞做飼養(yǎng)層。由于混雜了小鼠細(xì)胞，且hESCs暴露于小鼠的逆轉(zhuǎn)錄病毒中，這必將給臨床應(yīng)用帶來麻煩。目前，無飼養(yǎng)層、無血清、無動物源成分的培養(yǎng)體系尚不完善，飼養(yǎng)層仍是hESCs建系時不可缺少的因素。為了減少動物源成分，人源飼養(yǎng)層研究是一個必要的過渡階段。本研究從人成纖維細(xì)胞的生長狀態(tài)、傳代情況與MEFs作比較，探討了人成纖維細(xì)胞用于培養(yǎng)hESCs的可行性。

所用不同組織來源的細(xì)胞，在傳代2、3次后形態(tài)均呈纖維狀，但生長特性、老化進(jìn)程不同。包皮增殖力最旺盛，其中一株3歲男孩的包皮細(xì)胞傳55代，在40代時核型仍正常，與文獻(xiàn)報(bào)道至少可以傳42代才出現(xiàn)老化吻合。另外一株17歲男孩的包皮細(xì)胞，培養(yǎng)到32代時增殖力依然旺盛。子宮內(nèi)膜基質(zhì)和絨毛細(xì)胞傳15代，增殖能力無明顯減弱。輸卵管基質(zhì)細(xì)胞第四代增殖能力開始下降，細(xì)胞出現(xiàn)老化，胞體增大、胞漿內(nèi)顆粒增多。胎兒皮膚和肌肉細(xì)胞增殖力居中，三代之后接觸抑制明顯，出現(xiàn)局部大片脫落，但細(xì)胞長滿80%前仍可以繼續(xù)傳代，而其它細(xì)胞無抑制脫落現(xiàn)象。胎鼠成纖維細(xì)胞早代增殖力旺盛，可復(fù)層生長而無接觸抑制，第四代之后，幾乎不再增殖，5代后細(xì)胞明顯老化。細(xì)胞形態(tài)與傳代密度有關(guān)，密度適宜，形態(tài)較好;傳代過稀，增殖減慢，則胞體變大，胞漿內(nèi)顆粒增多，傳代周期變長。人成纖維細(xì)胞和MEFs在體外均為貼壁生長型細(xì)胞，與MEFs相比，人成纖細(xì)胞壽命更長，在生長狀況上與MEFs類似，在使用期限上優(yōu)于后者。

本結(jié)論與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道包皮可以支持hESCs生長、建系相符⑿⒁。但與2003年MarkRichards⒂認(rèn)為胎兒肌肉可作為最佳飼養(yǎng)層有異議，可能與細(xì)胞培養(yǎng)條件不同有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，胎兒肌肉細(xì)胞接觸抑制明顯，易脫落，飼養(yǎng)層細(xì)胞本身狀態(tài)不佳。Richards描述胎兒肌肉較其它飼養(yǎng)層上的上hESCs克隆厚，本實(shí)驗(yàn)中觀察到hESCs的生長形態(tài)及分化情況和飼養(yǎng)層細(xì)胞密度有關(guān)，而與組織來源無明顯關(guān)系。無論哪種飼養(yǎng)層，飼養(yǎng)層細(xì)胞密度大，則hESCs克隆厚，形態(tài)除與切割形狀有關(guān)外，多沿纖維方向生長，反之則薄，呈圓形、橢圓形。

絲裂霉素處理后的各種飼養(yǎng)層，輸卵管細(xì)胞分泌的bFGF量最高，SPSS統(tǒng)計(jì)分析與其它組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。但hESCs在包皮和輸卵管上生長形態(tài)均好，說明飼養(yǎng)層細(xì)胞自身分泌的bFGF和hESCs的生長雖然可能有一定關(guān)系，但無必然相關(guān)性。表現(xiàn)為輸卵管細(xì)胞支持hESCs生長時密度低，其它組織來源的細(xì)胞密度高。但也可能與輸卵管細(xì)胞體積較大有一定關(guān)系。當(dāng)然，細(xì)胞培養(yǎng)液中各種生長因子含量甚微，各種因子協(xié)同作用復(fù)雜，需要聯(lián)合其它因素才能進(jìn)一步探討它們的作用。

雖然輸卵管分泌的bFGF較高，密度要求比MEFs低，傳代的hESCs分化少形態(tài)好，膠原酶消化效果與MEFs類似。但是輸卵管上生長的hESCs貼壁率波動很大，實(shí)驗(yàn)中曾有另一株hESCs超過50%以上的克隆不貼壁現(xiàn)象。這可能與hESCs系不同有關(guān)，也可能與培養(yǎng)液的批次有關(guān)。另外，輸卵管需要篩選(比如排除惡性腫瘤患者)，來源相對困難，且在第四代后增殖力明顯下降，老化較早，這些都限制了它的應(yīng)用。子宮內(nèi)膜增殖力相對旺盛，來源也很充足，所以也是一種值得推薦的飼養(yǎng)層;胎兒肌肉和皮膚，細(xì)胞本身傳代需要嚴(yán)格控制時間，否則會“集體自殺”——大片脫落，給實(shí)驗(yàn)帶來一定的不便。這種現(xiàn)象其它細(xì)胞尚未見發(fā)生。另外，在如今可以控制受孕的醫(yī)療條件下，引產(chǎn)的正常胎兒來源非常困難且涉及到倫理問題。

盡管我們實(shí)驗(yàn)表明流產(chǎn)胎兒的絨毛也可以支持hESCs生長，國內(nèi)外尚未見報(bào)道，但絨毛取材相對困難，也牽涉到倫理問題。所以，應(yīng)該倡議飼養(yǎng)層的選擇不在于標(biāo)新立異，而在于方便、適用。雖然似乎多種人源成纖維細(xì)胞在一定程度上均可支持hESCs生長，本研究顯示包皮可作為人源飼養(yǎng)層的首選，并且，我們在包皮上成功地建立了一株新的hESCs系。包皮的優(yōu)勢體現(xiàn)在來源充足、屬醫(yī)療廢物，一般不需要病理檢查，無倫理學(xué)問題;本身傳代久，增殖力強(qiáng)，旺盛時可1：7傳代;不同包皮系、冷凍復(fù)蘇后及高代次細(xì)胞支持hESCs生長的能力均無差異，實(shí)驗(yàn)中最高用到31代。而MEFs在第5代時增殖力即明顯下降呈老化狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)多用3～4代。與MEFs相比，包皮的儲備量是很驚人的，這就減輕了反復(fù)培養(yǎng)原代飼養(yǎng)層細(xì)胞的工作負(fù)荷。

現(xiàn)階段的培養(yǎng)方法尚不能在短期內(nèi)大量擴(kuò)增hESCs，減少動物源性物質(zhì)只是基本前提，最終目標(biāo)是找到類似鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白拮抗劑Noggin和白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor，LIF)作用的細(xì)胞因子⒃⒄，使hESCs的自我更新具有可控性，建立起無飼養(yǎng)層、無血清和無動物來源成分的穩(wěn)定的、標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)體系。

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