【摘要】目的:選擇最佳人源飼養層，并檢測不同組織來源的人源飼養層細胞堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的分泌情況，探討其水平與人胚胎干細胞(hESCs)生長是否相關。方法：原代培養包皮真皮、子宮內膜基質、絨毛、輸卵管、胎兒真皮、胎兒肌肉及胎鼠成纖維細胞(MEFs);按組織來源分為7組(MEFs為對照)，同期接種同一株hESCs，從飼養層細胞密度、絲裂霉素作用時間等，尋找不同飼養層適合hESCs生長的最佳條件;按人體組織分6組，ELISA方法檢測各種人源飼養層細胞分泌的bFGF。結果：根據飼養層細胞生長特性，飼養層從優到劣依次為：包皮、子宮內膜、絨毛、輸卵管、胎皮、胎肌;根據hESCs生長狀況，飼養層排序為：包皮、輸卵管、子宮內膜、絨毛、胎肌、胎皮。輸卵管、包皮、絨毛、胎肌、子宮內膜、胎皮分泌的bFGF(pg•10-5•mL-1)分別為13.23;3.39，1.99;0.17，1.40;0.17，2.02;1.59，0.38;0.28，0.29;0.29。輸卵管與其它組織細胞分泌的bFGF差異均有統計學意義(P<0.01);包皮、絨毛、胎肌之間差異無統計學意義(P>0.05)，與子宮內膜、胎皮差異有統計學意義(P<0.05);子宮內膜與胎皮之間差異無統計學意義(P>0.05)。結論：包皮來源的飼養層最佳，輸卵管細胞分泌的bFGF量最高，飼養層細胞自身分泌的bFGF和hESCs生長無必然相關性。

【關鍵詞】人源飼養層;人胚胎干細胞;堿性成纖維細胞生長因子

基礎與臨床研究表明，胚胎干細胞(humanembryonicstemcells，hESCs)及其衍生細胞移植后可以有效修復受損組織①⑤。而hESCs增殖需要營養物質及生長因子，鼠胚胎成纖維細胞(mouseembryonicfibroblasts，MEFs)制作飼養層是最早和最常用的方法⑥⑦。然而，MEFs可能將鼠類病毒傳染給患者，干細胞治療人類疾病時，必須要求無動物源性培養。近幾年，人胚胎成纖維、包皮、輸卵管上皮、子宮內膜等組織來源的細胞⑧⑩，均有報道可以支持hESCs的生長，但對于各種人源飼養層的評價尚存在爭議，各實驗室結論不同。為選擇最佳人源飼養層，引導人源組織的取舍和應用，本研究選用包皮、子宮內膜、絨毛、輸卵管、胎兒皮膚、肌肉，6種不同的胎兒、小兒及成人組織作飼養層，以MEFs為對照，比較了它們對人胚胎干細胞的支持情況。MEFs促進增殖作用主要是由于能分泌成纖維細胞生長因子(fibroblastgrowthfactor，FGF)等促有絲分裂因子，但人源飼養層中生長因子含量復雜，哪些因子可促進hESCs增殖和抑制分化目前尚未明了。一般認為添加外源性合成的(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)有利于hESCs的生長，但飼養層細胞自身分泌的bFGF和hESCs生長是否存在相關性呢?我們測定了不同人源飼養層細胞分泌的bFGF，首次嘗試從飼養層細胞自身分泌的bFGF角度探討其與支持hESCs的生長是否存在相關性。

1、材料與方法

1.1 材料

1.1.1hESCs本課題組 從人囊胚中分離培養并經過鑒定的第30代細胞。

1.1.2 組織來源取自中山大學附屬一院。包皮：小兒外科的包皮環切術;子宮內膜：生殖中心子宮內膜診刮術;胎兒皮膚、肌肉：胎兒中心胎兒引產術;輸卵管、絨毛：婦產科輸卵管切除術和胎兒流產術;胎鼠購自中山大學動物中心。

1.1.3 試劑及培養液 HumanFGFBasicImmunoassayKit(DFB50RD，USA);成纖維細胞培養液：90%高糖DulbeccoModifiedEagleMedium(DMEM;invitrogen，USA)，10%fetalbovineserum(FBS;Hyclone，USA)，100IU/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素(Sigma，USA);hESCs培養液：80%Knockout-DMEM，20%Knockout-SR，L-谷氨酰胺100×β-巰基乙醇1.8μl/mL(Invitrogen，USA)，100IU/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、非必需氨基酸100×(Sigma，USA)。

1.2 方法

1.2.1 原代細胞 培養包皮、胎兒皮膚，胰酶過夜冷消化，取真皮膠原酶Ⅳ消化;胎兒肌肉、絨毛、胎鼠，0.25%胰酶消化;子宮內膜，0.1%膠原酶I消化后，將腺體沉淀取基質細胞;輸卵管，0.25%胰酶消化后，將基質和上皮層分離，取基質層用0.1%膠原酶Ⅳ消化。

1.2.2 最佳飼養層條件 選擇用10mg/L的絲裂霉素C分別作用各種細胞1h、1.5h、2h、2.5h、3h，用同一規格的培養皿，制作不同密度的飼養層，機械法將hESCs克隆切成3～16塊，轉移到鋪有飼養層的培養皿中，選擇最佳作用時間和密度。凍存大量同批次細胞備用，復蘇后計數鋪皿細胞數和未貼壁細胞數，按絲裂霉素處理和未處理分2組，比較絲裂霉C對不同細胞復蘇率的影響。復蘇率=(鋪皿細胞數-未貼壁細胞數)/鋪皿細胞數

1.2.3 飼養層 比較用同一規格的培養皿，接種相同的hESCs克隆數，計算在各種飼養層最佳條件下hESCs的貼壁率、生長率、分化率，比較飼養層優劣。貼壁率=貼壁克隆/傳代克隆;生長率=生長克隆/貼壁克隆;分化率=(部分分化克隆+已分化克隆)/克隆總數。

1.2.4 bFGF檢測 10mg/L的絲裂霉素C作用各種細胞2h，計數后放入培養皿，3d后吸取培養液，離心取上清;利用酶聯免疫吸附實驗的雙抗體夾心法，按照DFB50RD試劑盒說明操作。

1.2.5 統計學處理 實驗數據以xs表示，應用SPSS12.0軟件進行統計處理，采用單因素方差分析比較各實驗組之間的差異性。

2、結果

2.1 不同飼養層細胞試用情況

hESCs的生長形態及分化情況和飼養層細胞密度有關，飼養層密度小，克隆薄、圓;飼養層密度大，克隆厚、沿纖維方向生長。各種人源飼養層在一定程度上均可支持hESCs生長，以包皮較穩定。

2.2 絲裂霉素C對不同細胞復蘇率的影響

對包皮、子宮內膜、絨毛、MEFs等細胞復蘇率無明顯影響;胎兒肌肉、胎兒皮膚、輸卵管細胞處理后較未處理復蘇率變差(表2)。

2.3 hESCs的生長狀態

未分化hESCs：細胞小圓形，排列緊密，核仁清楚;已分化細胞：細胞大，梭形或多角形，細胞排列疏松。未分化克?。嚎寺≈形捶只毎?gt;80%，可繼續傳代;部分分化克隆：克隆中未分化細胞50%～80%，可通過機械法將未分化部分繼續傳代;已分化克隆：克隆中未分化細胞<50%，不能繼續傳代。

hESCs在包皮上貼壁率，生長率和分化率和MEFs類似;在輸卵管上貼壁率波動大，但分化率較低，形態較好;在胎皮、胎肌上貼壁率和生長率較MEFs差。

貼壁率：包皮、MEFs之間差異無統計學意義(P>0.05)，與其它組差異有統計學意義(P<0.01);子宮內膜、絨毛之間差異無統計學意義(P>0.05)，和胎皮、胎肌、輸卵管差異有統計學意義(P<0.01);胎皮、胎肌差異無統計學意義(P>0.05)和輸卵管差異有統計學意義(P<0.01)。

生長率：包皮、MEFs之間差異無統計學意義(P>0.05)，與其它組差異有統計學意義(P<0.01);子宮內膜、絨毛、輸卵管之間差異無統計學意義(P>0.05)，與胎皮、胎肌差異有統計學意義(P<0.01);胎皮、胎肌差異無統計學意義(P>0.05)。

分化率：輸卵管和所有組之間差異均有統計學意義(P<0.01);其它組間差異無統計學意義(P>0.05)(表3，圖2)。

2.4 不同組織的飼養層細胞分泌bFGF結果

輸卵管與其它組間差異均有統計學意義(P<0.01)，包皮、絨毛、胎肌之間差異無統計學意義(P>0.05);包皮、絨毛、胎肌與子宮內膜、胎皮之間差異有統計學意義(P<0.05);內膜與胎皮之間差異無統計學意義(P>0.05)。標準曲線r=0.99868說明本次實驗技術性誤差很小。

3、討論

1998年Thomson⑥首次報道從囊胚中獲得了hESCs，其發育全能性為細胞治療和組織替代等醫學領域帶來廣闊的研究前景，現在已成為生物醫學領域的熱點。傳統上，培養hESCs用MEFs、無限生長系STO細胞做飼養層。由于混雜了小鼠細胞，且hESCs暴露于小鼠的逆轉錄病毒中，這必將給臨床應用帶來麻煩。目前，無飼養層、無血清、無動物源成分的培養體系尚不完善，飼養層仍是hESCs建系時不可缺少的因素。為了減少動物源成分，人源飼養層研究是一個必要的過渡階段。本研究從人成纖維細胞的生長狀態、傳代情況與MEFs作比較，探討了人成纖維細胞用于培養hESCs的可行性。

所用不同組織來源的細胞，在傳代2、3次后形態均呈纖維狀，但生長特性、老化進程不同。包皮增殖力最旺盛，其中一株3歲男孩的包皮細胞傳55代，在40代時核型仍正常，與文獻報道至少可以傳42代才出現老化吻合。另外一株17歲男孩的包皮細胞，培養到32代時增殖力依然旺盛。子宮內膜基質和絨毛細胞傳15代，增殖能力無明顯減弱。輸卵管基質細胞第四代增殖能力開始下降，細胞出現老化，胞體增大、胞漿內顆粒增多。胎兒皮膚和肌肉細胞增殖力居中，三代之后接觸抑制明顯，出現局部大片脫落，但細胞長滿80%前仍可以繼續傳代，而其它細胞無抑制脫落現象。胎鼠成纖維細胞早代增殖力旺盛，可復層生長而無接觸抑制，第四代之后，幾乎不再增殖，5代后細胞明顯老化。細胞形態與傳代密度有關，密度適宜，形態較好;傳代過稀，增殖減慢，則胞體變大，胞漿內顆粒增多，傳代周期變長。人成纖維細胞和MEFs在體外均為貼壁生長型細胞，與MEFs相比，人成纖細胞壽命更長，在生長狀況上與MEFs類似，在使用期限上優于后者。

本結論與大多數文獻報道包皮可以支持hESCs生長、建系相符⑿⒁。但與2003年MarkRichards⒂認為胎兒肌肉可作為最佳飼養層有異議，可能與細胞培養條件不同有關。本實驗中，胎兒肌肉細胞接觸抑制明顯，易脫落，飼養層細胞本身狀態不佳。Richards描述胎兒肌肉較其它飼養層上的上hESCs克隆厚，本實驗中觀察到hESCs的生長形態及分化情況和飼養層細胞密度有關，而與組織來源無明顯關系。無論哪種飼養層，飼養層細胞密度大，則hESCs克隆厚，形態除與切割形狀有關外，多沿纖維方向生長，反之則薄，呈圓形、橢圓形。

絲裂霉素處理后的各種飼養層，輸卵管細胞分泌的bFGF量最高，SPSS統計分析與其它組間差異均有統計學意義(P<0.01)。但hESCs在包皮和輸卵管上生長形態均好，說明飼養層細胞自身分泌的bFGF和hESCs的生長雖然可能有一定關系，但無必然相關性。表現為輸卵管細胞支持hESCs生長時密度低，其它組織來源的細胞密度高。但也可能與輸卵管細胞體積較大有一定關系。當然，細胞培養液中各種生長因子含量甚微，各種因子協同作用復雜，需要聯合其它因素才能進一步探討它們的作用。

雖然輸卵管分泌的bFGF較高，密度要求比MEFs低，傳代的hESCs分化少形態好，膠原酶消化效果與MEFs類似。但是輸卵管上生長的hESCs貼壁率波動很大，實驗中曾有另一株hESCs超過50%以上的克隆不貼壁現象。這可能與hESCs系不同有關，也可能與培養液的批次有關。另外，輸卵管需要篩選(比如排除惡性腫瘤患者)，來源相對困難，且在第四代后增殖力明顯下降，老化較早，這些都限制了它的應用。子宮內膜增殖力相對旺盛，來源也很充足，所以也是一種值得推薦的飼養層;胎兒肌肉和皮膚，細胞本身傳代需要嚴格控制時間，否則會“集體自殺”——大片脫落，給實驗帶來一定的不便。這種現象其它細胞尚未見發生。另外，在如今可以控制受孕的醫療條件下，引產的正常胎兒來源非常困難且涉及到倫理問題。

盡管我們實驗表明流產胎兒的絨毛也可以支持hESCs生長，國內外尚未見報道，但絨毛取材相對困難，也牽涉到倫理問題。所以，應該倡議飼養層的選擇不在于標新立異，而在于方便、適用。雖然似乎多種人源成纖維細胞在一定程度上均可支持hESCs生長，本研究顯示包皮可作為人源飼養層的首選，并且，我們在包皮上成功地建立了一株新的hESCs系。包皮的優勢體現在來源充足、屬醫療廢物，一般不需要病理檢查，無倫理學問題;本身傳代久，增殖力強，旺盛時可1：7傳代;不同包皮系、冷凍復蘇后及高代次細胞支持hESCs生長的能力均無差異，實驗中最高用到31代。而MEFs在第5代時增殖力即明顯下降呈老化狀態，實驗多用3～4代。與MEFs相比，包皮的儲備量是很驚人的，這就減輕了反復培養原代飼養層細胞的工作負荷。

現階段的培養方法尚不能在短期內大量擴增hESCs，減少動物源性物質只是基本前提，最終目標是找到類似鼠胚胎干細胞培養中的骨形態發生蛋白拮抗劑Noggin和白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor，LIF)作用的細胞因子⒃⒄，使hESCs的自我更新具有可控性，建立起無飼養層、無血清和無動物來源成分的穩定的、標準的培養體系。

【參考文獻】

[1]Cho MS，Hwang DY，Kim DW.Efficient derivation of functional dopaminergic neurons from human embryonic stem cells on a large scale [J].Nat Protoc，2008，3(12)：1888-1894.

[2]Lu SJ，Ivanova Y，Feng Q，et al.Hemangioblasts from human embryonic stem cells generate multilayered blood vessels with functional smooth muscle cells [J].Regen Med，2009，4(1)：37-47.

[3]Karner E，Backesjo CM，Cedervall J，et al.Dynamics of gene expression during bone matrix formation in osteogenic cultures derived from human embryonic stem cells in vitro [J].Biochim Biophys Acta，2009，1790(2)：110-118.

[4]Mao GH，Chen GA，Bai HY，et al.The reversal of hyperglycaemia in diabetic mice using PLGA scaffolds seeded with islet-like cells derived from human embryonic stem cells [J].Biomaterials，2009，30(9)：1706-1714.

[5]Li Z，Han Z，Wu JC.Transplantation of human embryonic stem cell-derived endothelial cells for vascular diseases [J].Cell Biochem，2009，106(2)：194-199.

[6]Thomson JA，Itskovitz EJ，Shapiro SS，et al.Embryonic stem cell line derived from human blastocysts [J].Science，1998，282(5391)：1145-1147.

[7]Inamdar MS，Venu P，Srinivas MS，et al.Derivation and characterization of two sibling human embryonic stem cell lines from discarded Grade III embryos[J]. Stem Cells Dev，2009，18(3)：423-433.

[8]Kumar N，Hinduja I，Nagvenkar P，et al.Derivation and characterization of two genetically unique human embryonic stem cell lines on in-house derived human feeders [J].Stem Cells Dev，2009，18(3)：435-445.

[9]Sidhu KS，Ryan JP，Tuch BE.Derivation of a new human embryonic stem cell line，endeavour-1，and its clonal propagation [J].Stem Cells Dev，2008，17(1)： 41-51.

[10]Meng G，Liu S，Krawetz R，et al.A novel method for generating xeno-free human feeder cells for human embryonic stem cell culture [J].Stem Cells Dev， 2008，17(3)：413-422.

[11]Lee JB，Lee JE，Park JH，et al.Establishment and maintenance of human embryonic stem cell lines on human feeder cells derived from uterine endometrium under serum-free condition [J].Biol Reprod，2005，72(1)：42-49.

[12]Ellerstrom C，Strehl R，Moya K，et al.Derivation of a xeno-free human embryonic stem cell line [J].Stem Cells，2006，24(10)：2170-2176.

[13]Stram S，Inzunza J，Grinnemo KH,et al.Mechanical isolation of the inner cell mass is effective in derivation of new human embryonic stem cell lines [J]. Hum Reprod，2007，22(12)：3051-3058.

[14]Feki A，Bosman A，Dubuisson JB，et al.Derivation of the first Swiss human embryonic stem cell line from a single blastomere of an arrested four-cell stage embryo [J].Swiss Med Wkly，2008，138(37-38)：540-550.

[15]Mark Richards.Comparative evaluation of various human feeders or prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells [J].Stem Cells， 2003，21(7)：546-556.

[16]Trouillas M，Saucourt C，Guillotin B，et al.Three LIF-dependent signatures and gene clusters with atypical expression profiles，identified by transcriptome studies in mouse ES cells and early derivatives [J].BMC Genomics，2009，10：73.

[17]Chiba S，Lee YM，Zhou W，et al.Noggin enhances dopamine neuron production from human embryonic stem cells and improves behavioral outcome after transplantation into Parkinsonian rats [J].Stem Cells，2008，26(11)：2810-2820.